Badania ADME

Badania ADME

Badania ADME (Absorpcji, Dystrybucji, Metabolizmu i Wydalania) przeprowadzane są na każdym z etapów rozwoju leku w celu szczegółowego scharakteryzowania cząsteczek przed rozpoczęciem badań klinicznych. Eksperci zatrudnieni w laboratoriach Blirt specjalizują się w badaniach in vitro ADME-Tox. W ramach usług ADME in vitro w Blirt badane są: właściwości fizykochemiczne, przepuszczalność in vitro, wiązanie białek, metabolizm.


Określenie rozpuszczalności związków organicznych w wybranych rozpuszczalnikach dostarcza wstępnych informacji na temat badanych cząsteczek. Są to kluczowe dane podczas przedklinicznej fazy rozwoju cząsteczki- potencjalnego leku. Użycie zestawu odpowiednio dobranych rozpuszczalników dostarcza ekspertom cennych przesłanek, które pozwalają wnioskować na temat szybkości absorpcji i ekstrakcji potencjalnych leków w ciele człowieka.

Ilość potrzebnego związku2.5 mg ciała stałego (do badań rozpuszczalności)
1 mg ciała stałego (do przygotowania standardu)
Rozpuszczalnikiwoda, eter dietylowy, 5% wodny roztwór NaOH, 5% wodny roztwór NaHCO3, 5% wodny roztwór HCl, stężony kwas siarkowy, 85% kwas orto-fosforowy, 5% wodny roztwór glukozy, 0.9% wodny roztwór NaCl
Liczba powtórzeńn = 2 (alikwoty z filtracji)
Czas inkubacji1 doba
Temperatura inkubacjiTemperatura pokojowa
Metoda analitycznaHPLC-UV-VIS, Oznaczenia spektrofotometryczne
Dane wynikoweRozpuszczalność [mg/ml]


Test stabilności chemicznej pozwala określić stopień rozkładu związku, który zachodzi w skutek nieenzymatycznych procesów w buforowych roztworach wodnych (np.: hydroliza, utlenianie, rozpad katalizowany światłem). Stabilność chemiczna potencjalnych leków jest jednym z kluczowych do określenia parametrów ponieważ cząsteczki, które są wysoce niestabilne, nie są dobrymi kandydatami na leki ze względu na trudności w zachowaniu efektywnej terapeutycznie formulacji. Ponadto molekuły przeznaczone do podawania doustnego muszą wykazywać chemiczną odporność na niskie wartości pH. W ramach stosowanej procedury oferujemy zróżnicowany zakres pH.

Stężenie badanego związku1 μM
Stężenie DMSO0.33%
Punkty czasowe0, 5, 15, 30, 45, 120 min
Liczba powtórzeń2
Materiał wykorzystywany w płytkach inkubacyjnychPTFE (wszystkie punkty czasowe) i polipropylen (2 godz.)
Ilość potrzebnego związku50 µL 10 mM roztworu
Metoda analitycznaLC-MS/MS
Dane wynikowe% Wyjściowego związku w każdym z punktów czasowych
% Wyjściowego związku inkubowanego na płytce polipropylenowej względem PTFE


Współczynnik podziału potencjalnego leku pomiędzy niemieszającymi się fazami organiczną i wodną (przeważnie n-oktanol i woda) określany jest za pomocą techniki ekstrakcyjnej. Metoda analityczna wykorzystywana pomiaru stężenia uzależniona jest od właściwości fizykochemicznych badanej molekuły (przeważnie stosowana jest spektrofotometria UV-Vis). Związki organiczne wykazujące aktywność biologiczną, często są trudno rozpuszczalne w roztworach wodnych. W przypadku tego typu związków proponujemy innowacyjną metodę określania współczynnika podziału z użyciem technik chromatograficznych (bez wcześniejszej ekstrakcji z fazy wodnej do organicznej).

MetodaEkstrakcja w mikrorozdzielaczu
Rozpuszczalnik organicznyn-Oktanol
Proporcja Bufor:Oktanol50:1, 5:1, 1:2 (v/v)
Związki kontroli pozytywnejAcebutolol, Ketokonazol
Ilość potrzebnego związku1 mg ciała stałego
Metoda analitycznaUV-VIS lub HPLC-UV-VIS
Dane wynikoweLogP, Log D7.4


Zdolność cząsteczki do dysocjacji w środowisku fizjologicznym żyjącej komórki jest ważna ze względu na aktywność biologiczną leku. Zdolność ta określana jest poprzez stałą dysocjacji kwasowej (zwana również stałą kwasową) – Ka. Jonizacja cząsteczki ma wpływ na jej zdolność do absorbcji światła i kształt widma UV-Vis.

MetodaMiareczkowanie pH-metryczne lub metody spektrofotometryczne
Ilość potrzebnego związku1 mg ciała stałego
Dane wynikowepKa

Leki metabolizowane są w wielu miejscach w ciele, włączając w to ściany jelit, płuca, nerki i osocze. Niemniej jednak leki głównie są metabolizowane w wątrobie, która jest najbardziej aktywnym organem w przeliczeniu na jednostkę masy. W laboratoriach Blirt przeprowadzamy badania małych cząsteczek pod kątem ich stabilności: S9, mikrosomalne, oraz względem hepatocytów.


Frakcja wątrobowa S9 jest często wykorzystywana do wspomagania badań ADME in vitro, włączając w to fazę I i II metabolizmu. Frakcja S9 jest mieszaniną mikrosomów i cytozolu, które zawierają różnorodne enzymy zdolne do metabolizowania leków i mogą uzupełnione kofaktorami takimi jak NADPH i UDPGA. W naszym laboratorium dostępne są frakcje S9 z różnych gatunków aby umożliwić badanie różnic w metabolizmie leków.

Standardowy protokół badania stabilności S9:

Dostępne gatunkiCzłowiek, szczur, mysz, królik, pies, małpa
Stężenie badanego związku3 μM
Stężenie S91 mg/mL
Punkty czasowe0, 5, 15, 30, 45 min
Temperatura37°C
KofaktoryNADPH, UDPGA
KontrolePróba ślepa
Próba bez kofaktorów (tylko 45 min)
Próba pozytywna (2 związki)
Liczba powtórzeń3 próby/punkt czasowy dla badanego związku
1 próba/punkt czasowy dla kontroli
Metoda analitycznaLC-MS
Dane wynikoweProcent związku wyjściowego pozostałego po każdym z okresów inkubacji

Wewnętrzny klirens
Czas półtrwania


Mikrosomy wątrobowe są powszechnie używane jako element badań ADME in vitro. Zawierają one różnorodne enzymy metabolizujące leki i wykorzystywane są do badań potencjału dla metabolizmu pierwszego przejścia leków podawanych doustnie. Mikrosomy dobierane są od różnych dawców aby zminimalizować zmienność pomiędzy partiami wynikającej ze zmienności osobniczej. W laboratoriach Blirt oferujemy badania z wykorzystaniem mikrosomów pochodzących od różnych gatunków w celu poznania różnic w metabolizmie leków.

Standardowy protokół badania stabilności mikrosomalnej:

Dostępne gatunkiCzłowiek, szczur, mysz, królik, pies, małpa
Stężenie badanego związku3 μM
Stężenie mikosomów0.5 mg/mL
Punkty czasowe0, 5, 15, 30, 45 min
Temperatura37°C
KofaktoryNADPH
KontrolePróba ślepa
Próba bez kofaktorów (tylko 45 min)
Próba pozytywna (2 związki)
Liczba powtórzeń3 próby/punkt czasowy dla badanego związku
1 próba/punkt czasowy dla kontroli
Metoda analitycznaLC-MS
Dane wynikoweProcent związku wyjściowego pozostałego po każdym z okresów inkubacji

Wewnętrzny klirens
Czas półtrwania


Stabilność związków w płynach biologicznych jest ważnym czynnikiem ponieważ substancje, które ulegają szybkiej degradacji wykazują niską skuteczność in vivo. Informacje dotyczące stabilności badanego związku w osoczu są przydatne podczas wykonywania innych badań in vitro (np. badania wiązania białek osocza mogą stwarzać trudności interpretacyjne), badań in vivo (np. przechowywanie i operowanie próbkami podczas badań przedklinicznych i klinicznych może stwarzać problemy) oraz podczas badań przesiewowych leków, których szybka konwersja w osoczu jest zjawiskiem pożądanym (np. proleki).

Standardowy protokół badania stabilności w osoczu:

Dostępne gatunkiCzłowiek, szczur, mysz, królik, pies, małpa, bydło
Stężenie badanego związku1 μM
Punkty czasowe0, 15, 30, 60 i 120 min
Temperatura37°C
KontrolePróba ślepa
Próba pozytywna (1 związek)
Liczba powtórzeń3 próby/punkt czasowy dla badanego związku
1 próba/punkt czasowy dla kontroli
Metoda analitycznaLC-MS
Dane wynikoweProcent związku wyjściowego pozostałego po każdym z okresów inkubacji


Hepatocyty są powszechnie używane w badaniach ADME in vitro i wymagają nienaruszonych układów komórkowych. Nienaruszone hepatocyty zawierają większość enzymów metabolizujących leki wymaganych do badań czterech kategorii transformacji ksenobiotycznych: hydrolizy, redukcji, utleniania i koniugacji. Badanie przeprowadzane jest z udziałem ludzkich komórek Hep2G. W laboratoriach Blirt przeprowadzenie analiz z wykorzystaniem podstawowych kriokonserwowanych hepatocytów z różnych gatunków w celu zbadania różnic w metabolizmie.

Standardowy protokół badania stabilności w hepatocytach:

Układy testoweLudzkie komórki wątrobowe Hep2G, Człowiek, szczur, mysz, pies, małpa, świnia miniaturowa (kriokonserwowane hepatocyty)
Stężenie badanego związku3 µM
Punkty czasowe0, 5, 10, 20, 40 i 60 min
Temperatura37°C
KontrolePróba ślepa
Próba pozytywna (2 związki)
Liczba powtórzeń3 próby/punkt czasowy dla badanego związku
1 próba/punkt czasowy dla kontroli
Metoda analitycznaLC-MS
Dane wynikoweProcent związku wyjściowego pozostałego po każdym z okresów inkubacji

Wewnętrzny klirens
Czas półtrwania

Badania przepuszczalności i transportu potencjalnych leków przeprowadzane są w celu określenia potencjału absorpcyjnego i dystrybucyjnego przy podawaniu doustnym. Oferujemy testy służące do określenia zdolności małych cząsteczek do transportu pasywnego PAMPA.


Test: Parallel Artificial Membrane Permeation Assay (PAMPA) używany jest jako model in vitro przenikania i absorpcji pasywnej, transkomórkowej leków z użyciem filtrów membranowych PVDF wstępnie potraktowanych roztworem lipidu. Dyfuzja pasywna jest ważnym czynnikiem determinującym transport leku z przewodu pokarmowego, transport poprzez membrany bariery krew-mózg, jak również transport poprzez ściany komórkowe.

Standardowy protokół testu PAMPA:

Stężenie badanego związku10 μM
Liczba powtórzeń3
Skład membranyLecytyna w dodekanie (1% v/v)
Czas inkubacji16 godzin
TemperaturaTemperatura pokojowa
Ilość potrzebnego związku100 µL, 10 mM roztworu w DMSO
Marker integralnościLucifer Yellow
Metoda analitycznaLC-MS/MS lub HPLC-UV-VIS
Dane wynikoweLog Pe


Aby zrozumieć potencjał dystrybucyjny badanego związku oblicza się jaka część związku znajduje się w osoczu w formie niezwiązanej. Określa się to za pomocą dializy równowagowej. Miara wiązania do białek osocza związana jest z dystrybucją związku do tkanek w ciele. Wysoka wartość współczynnika wiązania do białek osocza potencjalnego leku, może spowodować wolniejszy metabolizm i eliminację. Dializa równowagowa jest najszerzej akceptowalną metodą określania wiązania badanych molekuł do białek osocza, ze względu na zminimalizowany (w porównaniu do innych metod np. ultrafiltracji) efekt wiązania niespecyficznego.

Standardowy protokół badania wiązania białek osocza:

MetodaDializa równowagowa (przy 10 %, 50 % lub 100 % osoczu)
Stężenie badanego związku5 μM (dostępne różne stężenia)
Liczba powtórzeń2
Ilość potrzebnego związku150 μL, 10 mM roztworu
Metoda analitycznaLC-MS/MS ilościowo (w osoczu i buforze standardowym)
Dane wynikoweUłamek niezwiązanego leku w 100% osoczu
Odzysk


Wiązanie z białkami krwi ma duży wpływ na farmakodynamikę badanych związków, ponieważ jedynie niezwiązana frakcja może oddziaływać z receptorami i wywoływać efekt farmakologiczny. Częściej określa się stężenie leku w osoczu niż w pełnej krwi. Jednak dla prawidłowej interpretacji wyników wskazane jest przeprowadzenie badań wiązania do specyficznych komponentów krwi.

Standardowy protokół badania wiązania do białek krwi:

Metoda badaniaRapid equilibrium dialysis (RED, Pierce)
(8K MWCO, podział: 100% krew-bufor)
Dostępne gatunkiStężenie badanego związku
Stężenie badanego związku5 µM
Czas inkubacji4h
Temperatura37°C
KontrolePróba ślepa
Kontrola dodatnia (2 związki: Metoprolol; Chlortalidon)
Liczba powtórzeń3 próby dla badanego związku
1 próba dla kontroli
Metoda analitycznaLC-MS
Dane wynikoweUłamek niezwiązanego leku w krwi
Odzysk


Skład tkanki i osocza jest bardzo różny. W danej objętości osocza znajduje się dwa razy więcej białek, a w mózgu 20 razy więcej lipidów.

Standardowy protokół badania wiązania do tkanki mózgu:

Metoda badaniaRapid equilibrium dialysis (RED, Pierce)
(8K MWCO, podział: 100% homogenat tkanki mózgu-bufor)
Dostępne gatunkiCzłowiek, szczur, mysz, królik, pies, małpa
Stężenie badanego związku5 µM
Czas inkubacji4h
Temperatura37°C
KontrolePróba ślepa
Kontrola dodatnia (2 związki: zależne od wyboru gatunku)
Liczba powtórzeń3 próby dla badanego związku
1 próba dla kontroli
Metoda analitycznaLC-MS
Dane wynikoweUłamek niezwiązanego leku 100% homogenacie tkanki mózgu
Odzysk


Zostało udowodnione, że wpływ na kinetykę metabolizmu w testach in vitro może mieć niespecyficzne wiązanie liposomalne, powodując problemy z dokładnym określeniem klirensu. Szereg przykładów dowodzi, że znajomość wiązania mikrosomalnego pozwala dokładniej zrozumieć zależności pomiędzy metabolizmem in vitro i farmakokinetyką in vivo.

Standardowy protokół badania wiązania mikrosomalnego:

Metoda badaniaRapid equilibrium dialysis (RED, Pierce)
(8K MWCO, podział: 100% mikrosomy-bufor)
Dostępne gatunkiCzłowiek, szczur, mysz, królik, pies, małpa
Stężenie badanego związku5 µM
Czas inkubacji4h
Temperatura37°C
KontrolePróba ślepa
Kontrola dodatnia (2 związki: Atenolol, Propranolol)
Liczba powtórzeń3 próby dla badanego związku
1 próba dla kontroli
Metoda analitycznaLC-MS
Metoda analitycznaUłamek niezwiązanego leku w mikrosomach
Odzysk


Podział pomiędzy krwią i osoczem obliczany jest z użyciem testów wiązania do białek osocza i białek krwi.