ZASADA IZOLACJI

Procedura oczyszczania DNA przeprowadzana jest z wykorzystaniem minikolumn wirowniczych, zawierających odpowiednie złoże krzemionkowe wydajnie i selektywnie wiążące kwasy nukleinowe. W pierwszym etapie do próbki DNA dodawany jest CB Buffer, który powoduje denaturację białek oraz umożliwia efektywne wiązanie DNA do złoża w minikolumnie. Dodatkowo bufor ten zawiera barwnik, który pozwala na kontrolowanie pH roztworu odpowiedniego dla efektywnego wiązania DNA do złoża. Dwuetapowe przemywanie DNA związanego do złoża ma na celu usunięcie pozostałych zanieczyszczeń i/lub inhibitorów reakcji enzymatycznych. Oczyszczone DNA eluowane jest ze złoża buforem o niskiej sile jonowej (Elution Buffer) lub wodą (pH 7,0–9,0) i gotowe jest do bezpośredniego wykorzystania w technikach biologii molekularnej (takich jak PCR, qPCR, Southern blotting, sekwencjonowanie, ligacja DNA, trawienie enzymami restrykcyjnymi itp.) lub może być przechowywane do późniejszego użycia.

SPECYFIKACJA PRODUKTU

MATERIAŁ WYJŚCIOWY

Próbka DNA o objętości do 100 μl

ODZYSK

90–99% w zależności od wielkości fragmentu DNA (w zakresie 100–10.000 pz)

WIELKOŚĆ IZOLOWANYCH FRAGMENTÓW DNA

100–10.000 pz
Możliwe jest również oczyszczanie fragmentów DNA w zakresach 50–100 pz i 10–30 kpz, a także genomowego i plazmidowego DNA, lecz z obniżoną wydajnością.

POJEMNOŚĆ ZŁOŻA

ok. 25 μg DNA

CZAS IZOLACJI

5–10 minut

CZYSTOŚĆ DNA

A ₂₆₀/_A280 = 1,7–1,9

SZCZEGÓLNE ZALECENIA I UWAGI

Elucja DNA ze złoża

Optymalną objętość buforu elucyjnego (Elution Buffer) należy dobrać w zależności od ilości DNA zawartego w próbce oraz od wymaganego poziomu stężenia DNA w eluacie. Zaleca się stosowanie 30–100 μl Elution Buffer. Jeśli pożądane jest otrzymanie DNA o wysokim stężeniu, objętość buforu elucyjnego można zmniejszyć do 20 μl. Należy mieć jednak na uwadze, że może to obniżyć wydajność odzysku DNA. Istotne w tym przypadku jest dodanie buforu elucyjnego centralnie na powierzchnię złoża. W celu uzyskania maksymalnej wydajności elucji DNA, bufor elucyjny należy podgrzać do temp. 80°C i wydłużyć czas inkubacji złoża z buforem do 10 minut. Jeśli istotne jest odzyskanie całkowitego DNA z minikolumny można przeprowadzić dodatkową elucję (200 μl). W tym przypadku należy powtórzyć pkt. 10-13 Protokołu izolacji DNA (sekcja XI), umieszczając minikolumnę w nowej probówce 1,5 ml typu Eppendorf. Elution Buffer nie zawiera EDTA, którego obecność może przeszkadzać w niektórych reakcjach enzymatycznych.

Kontrolowanie poziomu pH

CB Buffer zawiera wskaźnik pH, pozwalający na sprawdzenie, czy pH mieszaniny jest mniejsze niż 7,5 (kolor żółty), co gwarantuje wydajną adsorpcję DNA do złoża minikolumny. Gdy pH jest wyższe niż 7,5, roztwór zmieni barwę na różową. Może się tak zdarzyć w nielicznych przypadkach, np. gdy wartość pH próbki DNA bardzo odbiega od standardowych warunków wykorzystywanych przy operacjach z DNA (pH >9,0). Konieczne jest wtedy dodanie 10 μl 3 M octanu sodu (pH 5,2), który obniżając pH próbki zapewni wydajne wiązanie DNA do złoża. Wzrost pH CB Buffer powyżej wartości 7,5 powoduje diametralny spadek adsorpcji DNA do złoża w minikolumnie.